Morshedi M., Schuffner Alessandro., Henden M., Thomas D., Oehninger S.
Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 2001, 18(10): 575-577
Introdução
Diferentes abordagens têm sido implementadas para melhorar a recuperação e/ou a qualidade dos espermatozóides móveis após a criopreservação e o descongelamento. Separação por gradiente da fração de móveis antes do congelamento oferece a possibilidade de seleção de espermatozóides que retêm a motilidade até 24 horas. A inseminação intrauterina (IIU) com método de criopreservação prontos para inseminar com meios de crioprotetores como sacarose e glicerol com processamento com percol têm produzido melhores resultados quando comparado à criopreservação convencional. Além disso, seleção de uma população de espermatozóides com alta motilidade por swim-up mostra ser melhor para selecionar espermatozóides com acrossomia integro pós congelamento e aquecimento alem de motilidade e outros parâmetros funcionais. O objetivo deste estudo prospectivo foi avaliar o impacto de diferentes métodos de processamento de sêmen (amostras de sêmen criopreservado como um todo, IIU-pronta, e amostra lavada depois do descongelamento) para os parâmetros de motilidade.
Materiais e Métodos
Sêmen de 26 homens submetidos à avaliação da infertilidade (Grupo estudo) e cinco doadores férteis (controle grupo) foram examinados. As amostras com > 15×106/mL espermatozóides móveis foram incluídos. Para cada ejaculado independente três métodos de preparo foram testados: sêmen todo, IIU-pronto, e IIU-lavagem. Cada amostra foi dividida em duas frações iguais. Uma parte foi criopreservada como sêmen como um todo. A outra parte foi submetida a um gradiente de densidades durante 20 min. com a 380G, utilizando percol de 90 ou 40% (Sigma, St. Louis, MO), para separar os espermatozóides móveis para a criopreservação (IIU-ready). A fração de móveis foi lavada (10 min. a 380G), e resuspendido com meio HTF suplementado com 0,3% de albumina de soro humano (HSA-HTF, Irvine Scientific, Santa Ana, CA), antes da criopreservação. Para criopreservação, cada fração foi lenta e suavemente misturados com o meio de congelamento (TYB-G, Irvine). A relação do volume de sêmen para TYB-G foi de 1:1 e para a fração de móveis foi de 1:1 = 2: A mistura foi transferidas para criotubos, refrigerado por 1 h, e criopreservados em nitrogênio líquido por 20 min. As amostras foram descongeladas em banho-maria a 40 º C ± por 3 min. e analisadas. O sêmen descongelado como um todo foi avaliado e posteriormente lavado uma vez com HTF-HSA para prepará-lo para uma IIU (IIU-lavagem). Todas as alterações e diluições foram consideradas no calculo final dos parâmetros relatados. A taxa de criosobrevivência foi determinada como a relação entre a motilidade percentual entre o sêmen aquecido e pré congelamento. Foi realizada análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey-Kramer para análise de movimento, método de Barlett’s para análise das diferenças de desvio padrão, e teste de Kolmogorov-Smirnov para a avaliação das distribuições de Gaus foram utilizadas. Os dados são apresentados como média e desvio padrão §. O nível de significância foi fixado em P <0,05. Resultados Os parâmetros espermáticos de motilidade após submeter às amostras aos diferentes métodos de preparo são resumidos na tabela 1 No grupo de pacientes, a concentração de espermatozóides, motilidade progressiva, e taxa de criosobrevivência em amostras IIU-pronto foram significativamente superiores nas amostras criopreservadas como sêmen todo (P <0,05, P <0, 001, P <0, 001, respectivamente) e nas amostras IIU-lavagem (P < 0,01, P <0,05, P <0,01, respectivamente). No grupo doador, os vários métodos não apresentaram diferenças significativas. No grupo de pacientes, a porcentagem de espermatozóides rápidos foi significativamente maior no IUI-prontos e IIU-lavagem, quando comparadas com amostras de sêmen todo (P <0,05 e P <0,01, respectivamente). No grupo doador, esse percentual foi significativamente maior apenas em IIU-lavagem em relação ao sêmen todo (P <0,01). Discussão Criopreservação de sêmen ainda representa um valioso auxílio clínico no tratamento de infertilidade. Nos resultados pós-aquecimento foi feita uma comparação de três diferentes métodos de criopreservação / técnicas de processamento utilizadas rotineiramente para preparar o sêmen para IIU. Utilizamos também um método manual comumente utilizado para congelamento com vapor de nitrogênio. Notou-se que quando o método de gradiente de densidades foi utilizado e os parâmetros de motilidade pré criopreservação eram altos os parâmetros pós congelamento foram superiores também, incluindo a recuperação da motilidade espermática total e motilidade progressiva. Podemos especular que esse resultado é devido à remoção dos espermatozóides anormais bem como das células e seus possíveis efeitos prejudiciais, incluindo entre outros, a geração de espécies reativas de oxigênio. É reconhecido que a população de pacientes estudados aqui incluiu os homens normais ou apenas ligeiramente subnormais em relação às parâmetros espermáticos. Se isto é verdade também para as amostras com mais graves graus de oligoastenoteratozoospermia precisa ser estabelecida. Além disso, é igualmente reconhecido que os métodos de tratamento empregado têm diferenças inerentes. No entanto, as metodologias utilizadas não desviam da rotina de uma clinica e dos procedimentos diários realizados na maioria dos centros para processar amostras criopreservadas para IIU. Nós, visando explorar se algum destes métodos apresenta resultado melhor que o tornem mais adequado para a terapia de Inseminação otimizada. Investigar o resultado de gravidez de tais métodos é desejável. No entanto, na ausência de tais resultados, pode ser plausível supor que as amostras com maior número de espermatozóides móveis e com melhores características de motilidade podem ser superiores para alcançar a gravidez. Percol é um substituto seguro para a realização de gradiente. No entanto, vários estudos foram publicados, indicando que a qualidade das amostras processadas usando Percol é comparável a os gradientes aprovado atualmente em uso clínico. O processamento por Gradiente seleciona os espermatozóides com maior motilidade e morfologia superiores, e remove leucócitos que são conhecidos por induzir a danos durante o processamento. O método de IIU-pronta também adiciona conveniência na prática clínica. Como mencionado, se a motilidade e do número de espermatozóides móveis são considerados crucial para o sucesso, quer IIU-pronta ou IIU-lavada poderiam ser recomendada para pacientes e doadores em caso de criopreservação de sêmen para os procedimentos de IIU. Nosso programa de sêmen de doador usa atualmente amostras IIU-pronta processadas com ISolateTM (Isolate, Irvine). A taxa cumulativa de gravidez foi de 60% após um tratamento de 6 meses.